Um dos testes tem como base o PCR e revela se o paciente está com vírus no corpo. O outro, voltado para o diagnóstico sorológico e baseado no método de Elisa, mostra se o paciente esteve em contato com o novo coronavírus.

Os dois testes desenvolvidos no ICB poderão ser usados em cidades de pequeno e médio portes. Baixo custo, uso de reagentes nacionais, confiabilidade e rapidez nos resultados são algumas das características.

Aumento da testagem, rapidez nos resultados, aplicação em todo o País, alta confiabilidade, utilização de reagentes nacionais e baixo custo. Essas seis conquistas na luta contra o novo coronavírus estão reunidas em dois testes para a covid-19 desenvolvidos pelo Instituto de Ciências Biomédicas ICB da USP. Eles já tiveram sua eficácia comprovada e podem ser aplicados imediatamente.

Os testes poderão ser realizados em cidades de pequeno e médio porte, com baixo custo e resultados até no mesmo dia – o que possibilita que a pessoa infectada receba o tratamento correto e seja isolada o mais rapidamente possível.

Para desenvolver esses testes em um prazo relativamente curto – eles começaram a ser estudados em março –, os pesquisadores do ICB concentraram seus esforços em adequar ao diagnóstico da covid-19 equipamentos e metodologias já utilizados anteriormente para o diagnóstico de diversas outras doenças.

Um dos testes tem como base o PCR (Reação em Cadeia da Polimerase, na sigla em inglês), que revela se o paciente está com vírus no corpo. O outro, voltado para o diagnóstico sorológico e baseado no método de Elisa, indica se o paciente esteve em contato com o novo coronavírus.

Teste RT-PCR-ICB

Os estudos consistiram na adaptação para a covid-19 do PCR convencional, que serve para o diagnóstico de inúmeras doenças infecciosas, por exemplo, sarampo, influenza, tuberculose e problemas genéticos. No caso da covid-19, o teste – batizado como RT-PCR-ICB – analisa secreções das vias respiratórias para detectar a presença do novo coronavírus no corpo do paciente.

O novo teste tem altos índices de confiabilidade: 98% de sensibilidade (capacidade de detectar casos positivos) e 100% de especificidade (capacidade de excluir casos negativos).

Laboratório Central de Saúde Pública (Lacen): profissionais técnicos capacitados em Biologia Molecular com ênfase em Real Time PCR podem dar suporte às atividades de diagnóstico de covid-19 – Foto: José Gadelha / Fiocruz Rondônia

O RT-PCR-ICB será uma alternativa – com vantagens – a um dos testes mais utilizados no Brasil para diagnosticar covid-19: o PCR em Tempo Real (Real Time PCR, na sigla em inglês). Os estudos foram conduzidos pelo virologista Edison Luiz Durigon, coordenador do Laboratório de Virologia Clínica e Molecular do ICB.

Uma das novidades é que o RT-PCR-ICB será feito por meio de equipamentos existentes na maioria das universidades, hospitais e laboratórios, públicos e privados, localizados em diversas cidades do País. Esse equipamento, chamado termociclador, custa cerca de R$ 15 mil. No caso do Real Time, o equipamento chega a custar R$ 150 mil.

Outra diferença: o custo dos reagentes. O RT-PCR-ICB utiliza reagentes fabricados no Brasil, mais baratos e com entrega pelo fabricante em poucos dias. O Real Time usa insumos importados que, além de caros, estão demorando até dois meses para chegar ao Brasil.

Mais um diferencial: disponibilidade de mão de obra. Técnicos de nível médio e profissionais graduados em Biologia ou em Ciências Biomédicas possuem os conhecimentos necessários para a realização do RT-PCR-ICB. Já o Real Time só pode ser realizado por profissionais treinados pelo fabricante do termociclador, o que implica tempo para essa habilitação.

Com essas características, o Real Time é feito exclusivamente por grandes laboratórios, concentrados em grandes cidades. Com a alta demanda por testagens em todo o País, os resultados demoram para chegar aos pacientes – o que pode provocar demora também para a indicação do tratamento correto.

Há, também, a disparidade de custos para a realização de cada teste: cerca de R$ 15,00 para o RT-PCR-ICB, contra aproximadamente R$ 80,00 para o Real Time.

O resultado do RT-PCR-ICB demora o mesmo tempo do Real Time, aproximadamente seis horas. “Ambos têm as mesmas eficácia, sensibilidade e especificidade”, informa o professor Edison Luiz Durigon.

Teste Elisa-ICB

Os pesquisadores do ICB desenvolveram também um teste sorológico do tipo Elisa (Ensaio de Imunoabsorção Enzimática) específico para a covid-19 a partir de antígenos produzidos em seus laboratórios. Análises de amostras de sangue identificam a presença de anticorpos (IgA, IgM e IgG) no paciente para descobrir se ele está ou já esteve infectado pelo coronavírus, inclusive em casos assintomáticos. Seus índices de acerto são de 92% na detecção de casos positivos (sensibilidade) e de 98% na exclusão de casos negativos (especificidade).

Para esse teste, foram produzidas em laboratório proteínas do SARS-CoV-2 que reagem aos anticorpos de pacientes infectados. A equipe da pesquisadora Cristiane Guzzo analisou todos os fragmentos da proteína S (Spike, localizada na superfície do vírus) e da proteína N (do nucleocapsídeo, que envolve o material genético do vírus). Após uma série de testes com soros de pacientes positivos, foram identificados os fragmentos que reagem melhor com os anticorpos e garantem maior especificidade ao teste.

Uma microplaca de 96 poços usada para o teste Elisa – Foto: Jeffrey M. Vinocur

A proteína foi clonada e introduzida em bactérias E. coli, que foram usadas para expressá-la em grande quantidade. Para isso, as bactérias são colocadas em um equipamento que agita as amostras com rotações e temperaturas específicas. “Isso serve para otimizar o crescimento das bactérias. Quando elas atingem o ponto ideal, colocamos uma substância para induzir a produção da proteína”, explica a mestranda Ana Paula Barbosa, que participa do estudo.

Em seguida, as amostras são colocadas em um sonicador, que ajuda a romper as membranas das bactérias para liberar as proteínas. Por fim, é necessário separá-las das outras proteínas que a bactéria produziu, utilizando um equipamento de purificação. No caso da proteína S, que é insolúvel, foi necessária mais uma etapa: deixá-la solúvel sem perder totalmente a sua estrutura – e assim poder ser reconhecida pelos anticorpos. Esse trabalho foi feito no laboratório do professor Luís Carlos de Souza Ferreira, diretor do ICB.

“O processo todo exigiu a participação de equipes de três laboratórios do ICB, de diferentes especialidades”, informa o pesquisador. “A metodologia também é fruto de parcerias com empresas que trabalharam em conjunto com o ICB no desenvolvimento de kits de diagnóstico sorológico semelhante aos desenvolvidos para pessoas infectadas pelos vírus zika e da dengue.”

O Elisa-ICB apresenta vantagens em relação a testes similares, principalmente no custo de cada reação (cerca de R$ 20,00 em contrapartida a valores que podem chegar a R$ 500,00 em laboratórios particulares) e na procedência dos reagentes (nacionais, mais baratos e disponíveis no mercado, em vez de importados, mais caros e com demora na entrega).

A eficácia do Elisa-ICB foi comprovada em um estudo no qual foram testadas 934 pessoas, entre professores, alunos e funcionários do instituto. Daquele total, 9,3% das pessoas testadas tiveram resultado positivo para IgG, ou seja, foram expostas ao vírus e desenvolveram imunidade. Por outro lado, 1,5% das pessoas testadas apresentaram resultado positivo para IgA, indicativo de exposição recente ao vírus. “Aqueles que tiveram resultado confirmado para IgA também se submeteram ao teste molecular (PCR) para a identificação de pessoas que ainda estavam com o vírus no organismo”, acrescenta Ferreira.

Ampliação da testagem

Ambos os testes desenvolvidos pelo ICB podem contribuir para o manejo da infecção em populações, seja em empresas, organizações públicas ou privadas, e mesmo em municípios e cidades de pequeno e médio portes.

Um laboratório equipado para o RT-PCR-ICB pode fazer cerca de 100 testes por dia; para o Elisa-ICB, cerca de 500 testes. Esses números refletem a realidade de uma cidade como Araraquara, de 260 mil habitantes. Localizada no interior de São Paulo, Araraquara se destaca no combate à covid-19 em razão do número de testes que realiza, acima da maioria das cidades, e, em consequência, da baixa letalidade da doença: 0,99%, contra 3,6% da média nacional. Atualmente, a prefeitura de Araraquara demanda, por dia, cerca de 120 testes Real Time e 300 testes sorológicos.

Os testes desenvolvidos pelo ICB-USP resultarão em benefícios não só para o Brasil, mas também para os países que têm carência de grandes laboratórios e dificuldade para obter insumos para o Real Time. “O PCR convencional é uma tecnologia implantada há mais de 20 anos; hospitais e universidades do mundo todo já têm acesso a ela. A produção das proteínas para o Elisa também não é cara e pode ser realizada em qualquer país. Os dois métodos que desenvolvemos podem ser usados facilmente em países da África, da América do Sul ou do Caribe”, afirma o diretor do ICB.

Mais informações: atendimento à imprensa (11) 99998-0150, com José Roberto Ferreira, e-mail jroberto@academica.jor.br ou (11) 99912-8331, com Angela Trabbold, e-mail angela@academica.jor.br