Congelar amostras de células do sangue de voluntários para análises futuras é uma prática comum na pesquisa clínica, mas pode enviesar os resultados nos estudos com portadores de lúpus, segundo experimento feito na Universidade Federal de São Paulo (Unifesp).

Ao comparar amostras sanguíneas frescas e congeladas de pacientes acometidos por essa doença autoimune, os pesquisadores observaram diferenças nas taxas de proliferação de algumas das células do sistema imunológico: os linfócitos TCD4.

“Dados da literatura científica sugerem que os linfócitos de portadores de lúpus são mais frágeis e apresentam maior tendência à apoptose [morte celular programada]. Nossa hipótese é que as células mais fracas morreram durante o processo de criopreservação e isso criou um viés de seleção positiva. Apenas as mais fortes estavam se proliferando após o descongelamento e, por esse motivo, a taxa foi superior à das amostras frescas”, disse Luis Eduardo Coelho Andrade, chefe do Laboratório de Imuno-Reumatologia da Unifesp.

Com apoio da FAPESP, Andrade coordena um projeto cujo objetivo é entender o funcionamento dos linfócitos TCD4 – particularmente os subtipos Th1, Th2, Th17 e T reguladores (Treg) – em pacientes com lúpus.

A doença não tem causa conhecida e é caracterizada pelo ataque do sistema imunológico a tecidos saudáveis do corpo. Os alvos mais comuns são pele, articulações, rins e cérebro, mas outros órgãos também podem ser acometidos.

“Existem protocolos para congelar e descongelar as amostras sanguíneas bem lentamente, de forma a não danificá-las. Mas, por maior que seja o cuidado, a célula é cheia de água e formam-se cristais de gelo dentro dela. Algumas funções podem ser alteradas e queríamos ver o efeito da criopreservação sobre as células Th1, Th2, Th17 e Treg”, contou Andrade.

Amostras de sangue foram retiradas de 20 portadores de lúpus e 18 voluntários sadios pareados por sexo e idade. Parte das amostras de cada grupo foi congelada e as demais imediatamente usadas em ensaios de proliferação celular e observação de apoptose.

“A criopreservação fez aumentar a taxa de apoptose tanto nos linfócitos de voluntários sadios quanto nos de pacientes com lúpus. Mas o aumento da apoptose foi muito mais evidente nas células dos lúpicos”, afirmou Andrade.

Curiosamente, o congelamento fez aumentar a taxa de proliferação nos linfócitos Th2, Th17 e Treg dos portadores de lúpus. Já as taxas de proliferação das células Th1 congeladas estavam iguais às das amostras frescas. Nas culturas com células de voluntários sadios, a taxa de proliferação aumentou com o congelamento apenas no caso dos linfócitos Th1.

“Acreditamos que as células T sabidamente mais frágeis no paciente com lúpus tenham morrido durante o congelamento e restaram apenas as mais fortes nas amostras ao serem descongeladas. Já nas amostras frescas havia tanto as células mais viáveis quanto as degeneradas, que não conseguem se proliferar”, disse Andrade.

Os resultados – que deverão ser publicados em breve na revista Cryobiology – indicam que a criopreservação tem um impacto significativo nos resultados e afeta diferentemente as células de pessoas com e sem lúpus.

“Isso explica parte da controvérsia existente na literatura relacionada a estudos funcionais com células de portadores de lúpus. Sabemos que parte dos trabalhos foi feita com amostras de sangue frescas e, os demais, com amostras congeladas”, avaliou o pesquisador.

Para ele, nas pesquisas sobre lúpus, não seria recomendado usar amostras criopreservadas. “Pode até ser que em um determinado experimento esse viés de seleção positiva seja desejado, mas é preciso ter consciência desse fator na hora de desenhar o estudo”, disse.

Diferenças no soro

Em outro braço do projeto da Unifesp, foram realizados experimentos para testar uma teoria, proposta em estudos anteriores, de que o soro sanguíneo de portadores de lúpus conteria fatores que estimulam a apoptose de linfócitos.

“O número de linfócitos circulantes frequentemente está abaixo do normal no paciente com lúpus. E, quando isolamos essas células e começamos a trabalhar com elas em laboratório, é possível observar que já estão se degenerando e são sensíveis a qualquer procedimento. Fomos tentar entender por que isso ocorre”, contou Andrade.

Os pesquisadores recolheram soro de 23 portadores da doença autoimune e de um número equivalente de voluntários sadios pareados por sexo e idade.

“Fizemos um pool de soro lúpico e um pool de soro sadio. Pegamos então os linfócitos de cada indivíduo e colocamos em cultura contendo cada um dos soros para acompanhar as taxas de apoptose”, contou Andrade.

Ao incubar linfócitos TCD4 indiferenciados com o soro de pacientes sadios, a taxa de apoptose ficou em torno de 1,8%. O número subiu para 5,5% quando as células foram incubadas com o soro dos pacientes com lúpus. O aumento em torno de três vezes foi observado tanto nos linfócitos de pacientes com lúpus quanto nos de voluntários sadios.

Porém, ao olhar os linfócitos já diferenciados em células Th1, Th2, Th17 e Treg, o aumento da taxa de apoptose induzido pelo soro lúpico não foi observado.

“Os resultados sugerem que existe algum fator no soro sanguíneo do paciente lúpico que induz a apoptose dos linfócitos, mas não afeta as células diferenciadas. Nosso próximo passo é identificar quais moléculas existentes no soro são responsáveis por esse efeito”, contou Andrade.

Desequilíbrio

Em um terceiro braço do projeto, o grupo coordenado por Andrade avaliou a distribuição dos diferentes tipos de linfócitos em amostras de sangue e de urina de portadores de nefrite lúpica, uma das manifestações mais graves da doença, que pode levar à insuficiência renal e óbito.

Com auxílio de um citômetro de fluxo – equipamento que permite diferenciar por imunofluorescência cada tipo de célula presente em uma solução – o grupo avaliou como estava a proporção entre células efetoras (Th1, Th2 e Th17), que estimulam a inflamação, e células reguladoras (Treg), cuja ação é imunossupressora.

Os resultados foram divulgados em artigos no Brazilian Journal of Medical and Biological Research  e no Scandinavian Journal of Rheumatology.

“Ao analisar o sangue, observamos que a frequência de células Treg no lúpus (1,4%) é semelhante aos índices normais (1,1%). No entanto, a taxa de células T efetoras é maior no lúpus (10,8%) em comparação aos índices normais (6,1%). Portanto, a relação células efetoras e células reguladoras está desbalanceada no lúpus, o que provavelmente favorece a resposta autoimune observada nessa doença”, explicou Andrade.

Além das diferenças quantitativas, o experimento revelou que os linfócitos efetores dos pacientes com lúpus também expressavam maior quantidade de moléculas funcionais, ou seja, estavam mais ativos que os linfócitos efetores de voluntários sadios.

Os pesquisadores observaram nos portadores de nefrite lúpica – mas não em pacientes com outros tipos de nefropatia – uma correlação inversa: quanto maior era o nível de células Th1 na urina, menor era o nível no sangue. Houve também forte tendência a níveis reduzidos de células Treg na urina dos pacientes com nefrite lúpica. Para Andrade, esse dado pode servir de biomarcador para medir a inflamação no tecido renal.

“O processo inflamatório não está acontecendo no sangue e sim no tecido renal e a urina teoricamente expressa o que está se passando no rim. Portanto, se tenho um infiltrado grande de célula Th1 no tecido renal, o esperado é haver uma quantidade maior na urina do que no sangue periférico. Já quando o processo inflamatório está menos intenso no tecido, a proporção de Th1 no sangue será maior”, explicou.

No momento, o grupo está padronizando testes de imunocitoquímica (técnica que usa anticorpos para identificar células) com tecido coletado por meio de biópsia renal para observar a frequência de cada um dos subtipos de linfócitos. “Esperamos que os resultados reflitam o que foi observado na urina e então teremos certeza desse raciocínio”, disse Andrade.